RNAi干擾檢測核心要點概要

 　　RNAi干擾檢測是一個十分重要的環節。不管是設備還是環境都是要的合格，在進行干擾檢測之前應該考慮靶基因產物的半衰期及其在細胞中的豐度和表達調控機制。由于RNAi干擾檢測是通過降解靶基因RNA而達到一直基因表達的目的，因此它不使用于研究那些具有長半衰期的蛋白質在細胞中的功能，RNAi干擾檢測不能像基因敲除（gene knockout）一樣在特定的細胞中確實靶基因，它只能較大限度的抑制靶基因的表達，其抑制效率zui高可達95％以上，因此這種方法又被稱為基因敲減（gene knockdown）。據此，RNAi干擾檢測不適用于有些酶基因功能的研究，因為有時候微量的酶分子就可以在細胞中行使功能，酶基因表達的抑制并不能從表型上檢測到明顯的變化。
 
　　為了使RNAi干擾檢測達到理想效果，我們必須注意以下事項：
 
　　不同細胞的轉染效率不同，一次對于不同的轉染試劑和培養細胞需要通過預試驗來確定轉染的條件，對一種細胞行之有效的方法并不一定適用于另一種細胞。正常情況下生長狀況良好的細胞轉染效率比生長狀況較差的細胞要高。RNAi干擾檢測盡量采用傳代次數較少的細胞，因為轉染效率隨著傳代次數的增加而逐漸下降，一般采用傳代次數在50代以內的細胞進行轉染。對細胞的轉染效率影響比較大的另一種因素是細胞的生長密度，RNAi干擾檢測對貼壁的細胞來說，*轉染密度為30％～70％，太低或太高都會導致轉染效率的下降。
 
　　如果一個siRNA分子在細胞中不能抑制靶基因的表達，首先應該查明RNAi干擾檢測所采用的基因序列和試驗用的細胞系是否來源于同一物種，然后檢查所采用的基因序列是否是可靠的，因為它可能存在序列錯誤、突變（在腫瘤細胞中）或核苷酸多態性。
 
　　RNAi干擾檢測抑制靶基因的表達以后，先觀察細胞表型的變化，如細胞生長狀況與形狀的變化。然后通過免疫印記與免疫熒光檢測細胞內蛋白質水平的變化。如果沒有特異性的靶蛋白抗體，RNAi干擾檢測可以通過Northern印記確定其mRNA變化。
 
　　必須采取措施防止并消除可能的Rnase污染。因為極少量的Rnase就可以破壞整個RNAi干擾檢測試驗，而RNAase遍布整個實驗室，用適當的陽性siRNA對照優化轉染和檢測條件。對于大多數細胞來說看家基因是zui合適的陽性對照，用不同濃度的看家基因siRNA轉染細胞，RNAi干擾檢測48小時后檢測看家基因蛋白質或mRNA水平，以確定靶siRNA轉染的*條件，試驗中應包含1～2個陰性對照以確定siRNA分子對靶基因的抑制作用的特異性。
 
　　RNAi干擾檢測用于轉染的siRNA分子的濃度同靶基因的特性和細胞類型相關。濃度太高會導致細胞毒性，濃度太低則不易檢測到靶基因表達水平的變化一次用于轉染細胞的siRNA分子濃度一般在30～100nmol/L之間，體外合成的siRNA分子對靶基因的抑制作用是瞬時的，RNAi干擾檢測細胞中受到抑制的靶蛋白一般在轉染5～7天之后，即經過7～10個細胞增殖周期之后就可以逐漸恢復至正常水平。
 
　　上海基屹生物科技有限公司在操作RNAi干擾檢測這一方面有很好的經驗，歡迎廣大新老客戶，歡迎洽談！