淺談質粒載體的構建及類型

一、質粒載體必須具備的基本條件

   現行通用的基因克隆載體，絕大多數就是以質粒為基礎改建而成的。一般說來，一種理想的用作克隆載體的質粒必須滿足如下幾個方面的條件：
（1）具有復制起點

（2）具有抗菌素抗生基因

（3）具若干限制酶單一識別位點

（4）具有較小的分子量和較高的拷貝數 

二、質粒載體的選擇記號

　　在基因克隆中采用的質粒載體的選擇記號，包括有新陳代謝特性、對大腸桿菌素E1的免疫性，以及抗菌素抗性等多種。但絕大多靈敏的質粒載體都是使用抗菌素抗性記號。基因克隆實驗中常用的幾種抗菌素的作用方式及其抗性機理列于。

三、不同類型的質粒載體

　（1）高拷貝數的質粒載體
　　適于分離大量的高純度的克隆基因的DNA段。如ColE1、pMB1或它們的派生質粒。它們不僅具有低分子量、高拷貝數的優點，而且在沒有蛋白質合成的條件下仍能繼續復制。因此，若在處于對數生長晚期的含有ColE1一類質粒的大腸桿菌培養物中，加入適量的蛋白質合成抑制劑講如氯霉素或壯觀霉素處理之后，每個細胞中的質粒拷貝數則可擴增到1000～3000個之多。如果加入高濃度的尿核苷，質粒DNA又可進一步擴增2～3倍。


　（2）低拷貝數的質粒載體
　　適合于克隆含量過高對寄主代謝有害的DNA。例如，pLG338、pLG339及pHSG415。這類質粒載體的一個普遍性問題是，由于它們體積小、拷貝數低，與此相應的基因劑量也就較少，因此要制備大量的克隆DNA就很困難。


　（3）失控的質粒載體
　　失控的質粒載體（runaway plasmid vectors）：是一些低拷貝的質粒，其復制控制是溫度敏感型的，也就是說在不同的溫度下，拷貝數會有顯著的變化。
　　B.E.Uhlin等人（1979）首先發展了失控的質粒載體pBEU1和Pbeu2。這種質粒載體在30℃下，每個寄主細胞中只含有適量的拷貝數，而當培養溫度超過35℃時，質粒的復制便失去了控制，每個細胞中的拷貝數便持續上升。在這種高溫環境下，細胞的生長蛋白質的合成可按正常的速率持續2～3小時。這期間編碼在質粒載體上的基因產物便超過了常量。zui后，細胞生長受到了抑制，并失去了存活的能力，但在這個階段質粒DNA可累積到占細胞總DNA的50%。


　（4）插入失活型的質粒載體
　　選用插入失活型質粒，將外源DNA段插入在會導致選擇記號基因（如tetr、ampr、cmlr等）失活的位點，就有可能通過抗菌素抗性的篩選，大幅度地提高獲得陽性克隆的幾率。除了pDF471和Pdf42之外，都具有基因插入失活的克隆位點，因此都屬于插入失活型的質粒載體。


　（5）正選擇的質粒載體
　　正選擇質粒載體（direct selection vectors）：這種質粒載體具有具有直接選擇記號并賦予寄主細胞相應的表型。通過選擇具這種表型特征的轉化子，便可大大降低需要篩選的轉化子的數量，從而減輕了實驗的工作量，提高了選擇的敏感性。


　（6）表達型的質粒載體
　　使克隆在大腸桿菌中特定位點的外源真核基因的編碼序列置于大腸桿菌的轉錄-轉譯信號控制之下，并能在大腸桿菌細胞中正常轉錄并轉譯成相應蛋白質的克隆載體特稱為表達載體（expression vectors）。它分為表達型質粒載體和表達型噬菌體載體兩種不同的類型。　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　      一種典型的大腸桿菌表達型質粒載體的主要組成部分，包括大腸桿菌的啟動子及操縱全點序列、多克隆位點、轉錄及轉譯信號、質粒載體的復制起點及抗菌素抗性基因

     那些沒有經過以基因克隆為目標的體外修飾改造的質粒被成為天然質粒。在大腸桿菌中，常見的要用于基因克隆的天然質粒有ColE1RSF2124和pSC101等。
　　鑒于天然質粒用作基因克隆載體存在著不同程度的局限性，所以科學工作者便在其基礎上進行了修飾改造，首先發展出了一批低分子量、高拷貝、多選擇記號的質粒載體。