生物顯微鏡的內反射熒光技術原理

　　生物顯微鏡的內反射熒光技術原理
　　生物顯微鏡的內反射熒光技術利用全內反射產生的消逝波激發樣品，使樣品表面數百納米厚的薄層內的熒光團受到激發，再用高靈敏度和高時間分辨率的攝像機CCD來捕捉熒光并用計算機進行顯像，從而實現對生物樣品觀測的一種新生技術。由于消逝波特點及CCD的優勢使全內反射熒光顯微鏡具有高信噪比和高時間分辨率，因此它在對單分子的動態觀測具有很高的應用價值。
　　利用全內反射產生的消逝波激發樣品，使樣品表面數百納米厚的薄層內的熒光團受到激發，再用高靈敏度和高時間分辨率的攝像機CCD來捕捉熒光并用計算機進行顯像，從而實現對生物樣品觀測的一種新生技術。由于消逝波特點及CCD的優勢使全內反射熒光顯微鏡具有高信噪比和高時間分辨率，因此它在對單分子的動態觀測具有很高的應用價值。
　　全內反射熒光顯微鏡根據其結構的不同可分為目鏡型和棱鏡型兩種。
　　1.棱鏡型全內反射熒光顯微鏡
　　棱鏡型全內反射熒光顯微鏡就是利用激光經過棱鏡并產生全內反射，其消逝波照射已被熒光標記的生物樣品，其激發光從另一側進入目鏡，并被CCD相機捕捉，其光路圖如圖所示。
　　從光路圖我們可以看出，棱鏡型系統在實現上更加容易,它只需要激光光源、棱鏡和顯微鏡，它也不容易受到入射光信號的干擾，但由于消逝波在z軸方向上呈指數衰減，只能照射100nm的距離。在探測上，放置樣品的空間收到棱鏡的限制。另外由于目鏡和物鏡同樣品距離近，因此同其他儀器的配合也受到限制。目前棱鏡型全內反射熒光顯微鏡的發展很慢，在科學研究中一般很少用到。
　　2.物鏡型全內反射顯微鏡
　　在物鏡型全內反射顯微術中，顯微鏡的物鏡即作為收集樣品熒光信號的接收器，同時又作為發生全內反射的光學器件，如圖所示。
　　由于細胞的典型折射率為1.33～1.38 ，因此要想實現全內反射，物鏡的NA必須大于1.38。表達式為：
　　NA = nsinθ，nsinθ> nsinθc
　　NA為物鏡的數值孔徑，n、θ分別為物鏡的折射率(浸沒油)和孔徑角。θc為發生全反射的臨界角。當我們使用NA值為1. 4 的透鏡物鏡時，只有很小的一部分物鏡孔徑范圍(1.4 -1.38=0.02)可以被利用，這顯然增加了光束校準的難度，同時光束的強度也很難提高。如果我們使用NA=1. 65的透鏡物鏡，則有一個大的多的孔徑范圍(1.65-1.38=0.27)可被利用，即有更多的激發光強可以用來產生全反射。
　　物鏡型的全內反射熒光顯微鏡在制作要求的技術很高，它是近年來全內反射熒光顯微鏡的發展方向，由于它的物鏡同收集樣品熒光的儀器在同一側，這有助于同其他的儀器等的結合。
　　內反射熒光顯微鏡的優勢應用和發展展望：
　　全內反射熒光顯微鏡里用消逝波作為陽品的激發光源，并用有著高靈敏度和高時間分辨率的CCD相機捕捉樣品熒光，因此具有如下優點：
　　1.信噪比高(相對共聚焦顯微鏡);
　　2.分辨率高(相對其他的光學顯微鏡);
　　3.對生物樣本損傷小(相對電鏡)，可以進行活體物質的研究和單分子的動態研究。
　　全內反射熒光顯微術正是憑借其*的優勢，它的熒光激發深度只在～100nm的薄層范圍內，從而成為研究細胞表面科學如生物化學動力學、單分子動力學的前途的光學成像技術。
　　全內反射熒光顯微成像法不再采用掃描成像，大大提高了成像速度，可以滿足實時成像的要求;另一方面它的圖像解釋相對于近場，干涉顯微成像來說也較簡單。